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支原體qPCR檢測(cè)——Venor Gem qEP的使用前準(zhǔn)備

更新時(shí)間:2023-09-30  |  點(diǎn)擊率:513

支原體檢測(cè)的應(yīng)用

支原體是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,常見(jiàn)的一類污染物。

在干細(xì)胞治療、免疫細(xì)胞治療、CAR-T、抗體藥生產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)相關(guān)的等臨床臨床項(xiàng)目,以及細(xì)胞典藏等重大的細(xì)胞培養(yǎng)項(xiàng)目,都需要進(jìn)行支原體放行檢測(cè),以確保產(chǎn)物沒(méi)有支原體污染。

?因此,需要建立結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快捷、通過(guò)《藥典》方法驗(yàn)證的檢測(cè)手段。

產(chǎn)品名稱:支原體qPCR檢測(cè)試劑盒 (經(jīng)典法)

英文:Venor®Gem qEP    

貨號(hào):11-9025    

品牌:Minerva Biolabs®    

規(guī)格:25次/盒    

特點(diǎn):遵循歐洲藥典和日本藥典檢查的流程,通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證;靈敏度高;特異性強(qiáng),操作便捷。



產(chǎn)品用途


德國(guó)Minerva Biolabs公司的Venor® GeM qEP kit,用于定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物,及其他生物基質(zhì)中的柔膜體綱微生物,如支原體、無(wú)膽甾原體、螺原體。

作用原理


通過(guò)擴(kuò)增16S rRNA編碼區(qū)特異性檢測(cè)支原體,而真核生物和其他細(xì)菌DNA不能通過(guò)Venor®GeM qEP Kit擴(kuò)增。


試劑盒包含所有必要的PCR組分,內(nèi)控DNA可用于鑒定PCR抑制,或DNA抽提問(wèn)題帶來(lái)的假陰性。內(nèi)控DNA可直接加到PCR預(yù)混液里,或加到DNA抽提之前的樣本中。它可用于驗(yàn)證DNA抽提和qPCR擴(kuò)增過(guò)程。它可從Minerva廠家購(gòu)買(貨號(hào)11-9905)。內(nèi)控對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果在560nm檢測(cè)(HEX通道),而支原體的擴(kuò)增在520nm檢測(cè)(FAM通道)。

試劑盒包括dUTP,它替代dTTP,方便用尿嘧啶DNA糖基酶(UNG)監(jiān)視假陽(yáng)性。該試劑盒不包含UNG。


實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備


一、細(xì)胞培養(yǎng)篩查

細(xì)胞應(yīng)長(zhǎng)滿90%以上。細(xì)胞上清可直接用于支原體檢查,無(wú)需再樣品制備。但上清中可能累積抑制PCR的物質(zhì),此時(shí)有必要進(jìn)行DNA抽提。未有證據(jù)表明,細(xì)胞培養(yǎng)基中的青鏈霉素存在抑制支原體或影響檢測(cè)的靈敏度的情況。

細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體數(shù)量平均為1×10^6/ml,至多為1×10^8/ml,足以滿足PCR的檢測(cè)要求。PCR的模板制備如下:

1.轉(zhuǎn)移500μl細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5ml EP管,蓋緊蓋。

2.樣本孵育95℃10分鐘。

3.樣本最大轉(zhuǎn)速離心(15s)以沉淀細(xì)胞碎片。

4.取2μl直接用于qPCR,或樣品儲(chǔ)存在4℃,最多6天。長(zhǎng)期保存在-20℃。


二、符合藥典的樣品檢查

1、濃縮樣品(可選步驟)

樣品基質(zhì)可能對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度有至關(guān)重要的影響。進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度的一種方法是收集和篩選比支原體DNA提取所需的更大樣本量的細(xì)胞培養(yǎng)上清(例如,Venor®GeM樣品制備試劑盒>200 μl),并執(zhí)行樣品濃縮步驟。

①轉(zhuǎn)移≤1ml樣品上清至1.5ml離心管。

②離心≥10000 × g 15分鐘(或≥13000× g  6分鐘),以沉淀支原體顆粒。

③棄掉上清,用200ml Tris緩沖液(10mM Tris-HCl,pH8.4)重懸沉淀。

④樣本渦旋混勻,然后直接進(jìn)行樣本穩(wěn)定化處理或DNA抽提。


2.樣品穩(wěn)定化

細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有高濃度的DNA酶,即使在較低的溫度下也會(huì)降解支原體DNA。因此,我們建議采取以下步驟來(lái)穩(wěn)定樣品。如果在樣品采集后立即進(jìn)行DNA提取,則不需要此步驟。請(qǐng)注意,在樣品濃縮步驟之前,不能通過(guò)熱失活來(lái)穩(wěn)定樣品。

①轉(zhuǎn)移500ml細(xì)胞培養(yǎng)上清至1.5ml離心管。蓋上管蓋。

②95℃孵育10分鐘。

③最大速度進(jìn)行樣本離心(15秒),以沉淀細(xì)胞碎片。

④樣本即可用于DNA抽提,或儲(chǔ)存在4℃,最多6天。長(zhǎng)期保存在-18℃以下。


3.DNA 抽提

大量證據(jù)表明,DNA抽提可實(shí)現(xiàn)最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法,但應(yīng)適合支原體基因組。我們推薦:

Venor®GeM Sample Preparation kits (貨號(hào)56-1010/-1050/-1200) 適合手動(dòng)DNA抽提。

這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過(guò)大量驗(yàn)證,具體流程參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。


注意事項(xiàng)

??由于細(xì)胞團(tuán)塊對(duì)PCR反應(yīng)的負(fù)面影響,不能直接使用細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行檢測(cè)。因此,細(xì)胞團(tuán)塊,或其他生物材料,如疫苗、冷凍儲(chǔ)存和石蠟包埋的樣品,需要在PCR前提取DNA。

已知樣品中胎牛血清(FCS)含量(> 5%)會(huì)增加PCR抑制的可能性。為了避免假陰性結(jié)果,這些樣品可能需要在PCR之前,也需要進(jìn)行DNA提取。

Venor®GeM qEP試劑盒與Venor®GeM樣品制備試劑盒(Cat:No. 56-1010/-1050/-1200)用于支原體DNA提取

??樣品濃縮步驟只適用于完整的支原體細(xì)胞。因此,應(yīng)避免在樣品濃縮之前進(jìn)行“樣品穩(wěn)定",即不能再濃縮前進(jìn)行任何破壞細(xì)胞的程序(如熱失活),請(qǐng)參見(jiàn)“2.樣品穩(wěn)定化"??芍苯犹幚眢w積為200 μl的樣品,無(wú)需濃縮步驟。


??Venor®GeM qEP kit包含的內(nèi)控DNA對(duì)照,也用于驗(yàn)證DNA抽提步驟。


??樣本濃縮時(shí)不要加內(nèi)控DNA。


??內(nèi)控DNA可單獨(dú)購(gòu)買(貨號(hào)11-9905)。


??PCR抑制可能因樣本基質(zhì)或者洗脫液產(chǎn)生。因而我們推薦Venor®GeM Sample Preparation kit用于DNA制備,其他品牌試劑盒需要經(jīng)過(guò)試驗(yàn)以保證合格。