研究表明,37%的細(xì)胞培養(yǎng)上清和幾乎所有的混合細(xì)胞培養(yǎng)上清,都存在抑制PCR的物質(zhì)。因此,在對(duì)細(xì)胞或者細(xì)胞產(chǎn)物,進(jìn)行支原體PCR檢測(cè)前,需要進(jìn)行DNA提取。
產(chǎn)品名稱:支原體DNA抽提試劑盒
英文:Venor®GeM Sample preparation Kit
品牌:Minerva-Biolabs®
貨號(hào):56-1010
規(guī)格:10次/盒
產(chǎn)品用途
細(xì)胞培養(yǎng)基隨著時(shí)間的延長(zhǎng),可能積聚抑制 PCR 的物質(zhì)。
已知血清含量大于 12%的培養(yǎng)基 對(duì)下游操作(例如 PCR)有抑制作用。而且,培養(yǎng)基中的酚紅,對(duì) qPCR 的熒光檢測(cè)也可能發(fā)生交叉反應(yīng),產(chǎn)生假陽(yáng)性。這些弊端可通過(guò)支原體 DNA 提取試劑盒來(lái)克服
從細(xì)胞培養(yǎng)物和生物藥中提取支原體 DNA,和支原體檢測(cè)試劑盒配套使用。提高支原體檢測(cè)的靈敏度、一致性和特異性。
作用原理
該試劑盒對(duì)支原體DNA的提取,主要由以下四步組成:
1、細(xì)胞裂解
2、DNA 吸附到核酸純化柱上
3、去除殘留污染物和抑制劑
4、DNA 洗脫。此方法無(wú)須酚/氯仿抽提,只需 30 分鐘即可完成制備,提供 PCR所需的 DNA。
使用方法
一、樣本要求
支原體 DNA 提取試劑盒可從數(shù)量上限為 1X 10^6 細(xì)胞/ml,體積上限為 500μl的細(xì)胞上清中,直接分離 DNA。
通常,細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)盡快進(jìn)行 DNA 抽提。
在 95℃加熱 10 分鐘以使之穩(wěn)定,繼而在室溫可放 1 周。富含蛋白的樣本(蛋白含量>10mg/ml)可能需要蛋白酶 K 處理后,再抽提 DNA(請(qǐng)參照后面的流程)。注意,此試劑盒不適于提取真核細(xì)胞組織的 DNA。
二、操作步驟
新試劑盒拆封后,向緩沖液 A1 和緩沖液 A2 加入無(wú)水乙醇。將恒溫儀設(shè)置到 70℃。使緩沖液 E 加熱到 70℃。
1、200μl 樣本+200μl 調(diào)節(jié)液,渦旋振蕩 10 秒。
2、搖 床 孵 育70℃,10 分鐘。
3、加 400μl 吸附緩沖液,渦旋振蕩 10 秒。
4、將液體轉(zhuǎn)移到核酸純化柱,離心10000g,1 分鐘,棄掉流過(guò)的液體。
5、加500μl緩沖液A1,離心10000g,1 分鐘,棄掉流過(guò)的液體。
6、加500μl緩沖液A2,離心10000g,1 分鐘,棄掉流過(guò)的液體。
7、最大速度離心,3 分鐘
8、換管。
9、加 60μl 緩沖液E,孵育 2 分鐘。
10、離心8000g,2分鐘。
11、DNA即可用于PCR。
三、注意事項(xiàng)
??提供的試劑不能和其他批號(hào)的試劑混和。
??使用的試劑不要超過(guò)效期。
規(guī)范操作流程,任何提取流程上的偏差都會(huì)影響到結(jié)果。
??我們推薦使用對(duì)照品,以驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。它也有助于排除故障。
??不要使用其他酒精來(lái)替代乙醇,它將導(dǎo)致核酸產(chǎn)量的下降。
??緩沖液 E 的預(yù)熱,會(huì)很大程度上改善核酸的產(chǎn)量。