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簡析我國藥典中對(duì)新生牛血清的要求

更新時(shí)間:2024-04-30  |  點(diǎn)擊率:320

我國藥典中規(guī)定,新生牛血清是從出生14小時(shí)內(nèi)未進(jìn)食的新生牛采血分離血清,經(jīng)除菌過濾后制成。牛血清生產(chǎn)過程中不得任意添加其他物質(zhì)成分。新生牛血清應(yīng)進(jìn)行以下檢查,符合規(guī)定后方可使用。

如釆用經(jīng)過驗(yàn)證的病毒滅活工藝處理的牛血清,大腸埃希菌噬菌體及病毒檢測(cè)必須在滅活前取樣進(jìn)行。

pH值:應(yīng)為7.00~8.50

蛋白質(zhì)含量:采用雙縮脲法(通則0731第三法)或其他適宜方法測(cè)定,應(yīng)為35~50g/L。

血紅蛋白:用分光光度法或其他適宜的方法測(cè)定,應(yīng)不高于200mg/L。

滲透壓摩爾濃度:應(yīng)為250~330mOsmol/kg(通則0632)。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查:應(yīng)不高于10EU/ml(通則1143凝膠限度試驗(yàn))。

支持細(xì)胞增殖檢查:采用傳代細(xì)胞(HFL1、Mv1 Lu、VeroCHO)中的任意1種細(xì)胞及Sp2/0-Ag14細(xì)胞進(jìn)行。細(xì)胞復(fù)蘇后,用待測(cè)樣品配制的培養(yǎng)液至少連續(xù)傳3代后使用,取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1)細(xì)胞生長曲線的測(cè)定  取供試品按10%濃度配制細(xì)胞培養(yǎng)液,Sp2/0-Ag14按每1ml1×10^4的細(xì)胞濃度,其他貼壁細(xì)胞按2×104的細(xì)胞濃度接種細(xì)胞,每天計(jì)數(shù)活細(xì)胞,連續(xù)觀察1周,并繪制生長曲線。

2)細(xì)胞倍增時(shí)間的測(cè)定  按生長曲線計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間。取細(xì)胞峰值前一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)(Y)、接種細(xì)胞數(shù)(X)及生長時(shí)間(T)計(jì)算。

Sp2/0-Ag14細(xì)胞應(yīng)不超過20小時(shí);HFL1細(xì)胞應(yīng)不超過22小時(shí);Mv1 Lu細(xì)胞應(yīng)不超過24小時(shí);Vero細(xì)胞應(yīng)不超過18小時(shí);CHO細(xì)胞應(yīng)不超過22小時(shí)。

3)克隆率的測(cè)定  將細(xì)胞稀釋至每1ml10個(gè)活細(xì)胞的濃度,按每孔1個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每板至少接種60孔,于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng),定期觀察細(xì)胞克隆生長情況,培養(yǎng)1周后計(jì)數(shù)每孔中的細(xì)胞克隆數(shù),并計(jì)算克隆率,應(yīng)不低于70%。


無菌檢查:依法則檢查(通則1101),應(yīng)符合規(guī)定。

支原體檢查:依法則檢查(通則3301),應(yīng)符合規(guī)定。

大腸埃希菌噬菌體:采用噬斑法和增殖法檢測(cè)。不得有噬菌體污染。

病毒檢查:

1)樣品制備 取約250ml的新生牛血清供試品用于檢測(cè),將其配制成含15%供試品的培養(yǎng)液,用于檢測(cè)全過程的細(xì)胞換液及傳代,以檢測(cè)合格的血清作為陰性對(duì)照血清。

2)指示細(xì)胞制備 至少采用猴源(如Vero細(xì)胞)、2種牛源細(xì)胞(BTMDBK細(xì)胞或無病毒污染的原代牛腎細(xì)胞)以及人二倍體細(xì)胞作為指示細(xì)胞,細(xì)胞復(fù)蘇后至少傳代1次后使用,根據(jù)所需量制備足夠量的細(xì)胞。

3)用含有供試品的培養(yǎng)液將4種指示細(xì)胞分別接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,接種量應(yīng)使細(xì)胞在培養(yǎng)7天后可達(dá)到至少80%90%匯合。同時(shí)制備陰性對(duì)照血清培養(yǎng)瓶。將培養(yǎng)瓶置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少7天。可在第5天時(shí)換液一次。

4)第7天進(jìn)行第1次盲傳,將接種供試品及陰性對(duì)照的每種指示細(xì)胞培養(yǎng)瓶分別傳出至少2個(gè)75cm2培養(yǎng)瓶,繼續(xù)培養(yǎng)至第14天,在第12天時(shí)可換液一次。

5)在第13天時(shí)(或第2次傳代前1天)或陰性對(duì)照瓶細(xì)胞達(dá)到至少70%匯合時(shí),制備陽性對(duì)照用細(xì)胞。即取1個(gè)陰性對(duì)照細(xì)胞瓶分別傳至6孔板或其他適宜的細(xì)胞板中用于細(xì)胞病變觀察(CPE)、血吸附檢查(HAd)及熒光抗體檢測(cè)(IF),次日接種陽性對(duì)照病毒。

6)第14天時(shí)進(jìn)行第2次盲傳。將第1次傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)物分別傳至6孔板或其他適宜的細(xì)胞板中,進(jìn)行細(xì)胞病變觀察及HAd檢查時(shí),接種于每種指示細(xì)胞上的待測(cè)樣本至少接種3孔;進(jìn)行熒光抗體檢測(cè)時(shí),接種于每種指示細(xì)胞上的待測(cè)樣本進(jìn)行每種病毒檢測(cè)時(shí)至少接種2孔。繼續(xù)培養(yǎng)至少至第21天,剩余細(xì)胞樣本-60℃或以下保存?zhèn)溆谩?/span>

7)在第14天接種陽性對(duì)照病毒:取(5)制備的指示細(xì)胞接種適量陽性對(duì)照病毒,置36℃±1℃、5%CO2培養(yǎng)箱吸附2小時(shí),吸棄上清液,加入適量細(xì)胞維持液,置36℃±1℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天,對(duì)于BT細(xì)胞,BVDV可作為病變陽性對(duì)照,BPI3可作為HAd陽性對(duì)照,牛副流感病毒3型(PI3)、牛腺病毒(BAV-3)、牛細(xì)小病毒(BPV)以及牛腹瀉病毒(BVDV)可作為IF檢測(cè)陽性對(duì)照;對(duì)于MDBK細(xì)胞,呼腸孤病毒3型(REO3)和PI3可分別作為細(xì)胞病變及HAd檢查陽性對(duì)照,PI3BAV-3、BVDV、REO-3IF檢測(cè)陽性對(duì)照;對(duì)于Vero細(xì)胞,Pl3可作為細(xì)胞病變及HAd檢查陽性對(duì)照,PI3REO-3作為IF檢測(cè)陽性對(duì)照??刹辉O(shè)立狂犬病病毒(Rabies)陽性對(duì)照。所有IF檢測(cè)陽性對(duì)照病毒應(yīng)接種100300CCID50。

8)接種陰性對(duì)照及供試品的細(xì)胞培養(yǎng)物在接種后每日觀察細(xì)胞病變情況,在接種后至少21天或末次傳代后至少7天時(shí)分別進(jìn)行病變觀察、HAd檢查及IF檢測(cè),陽性對(duì)照培養(yǎng)物在接種后第7天或10%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)可進(jìn)行IF檢測(cè)。

進(jìn)行血吸附檢查時(shí),用雞與豚鼠血紅細(xì)胞在28℃2025℃進(jìn)行檢測(cè)。

進(jìn)行熒光抗體檢測(cè)時(shí),將細(xì)胞固定后采用直接或間接免疫熒光抗體檢查法,至少應(yīng)對(duì)BVDV、PI3、BAV-3、BPV、REO3以及 Rabies進(jìn)行檢查,結(jié)果均應(yīng)為陰性。

9)結(jié)果判定 陰性對(duì)照應(yīng)無細(xì)胞病變,血吸附檢查應(yīng)為陰性,熒光抗體檢測(cè)應(yīng)為陰性;陽性對(duì)照應(yīng)有明顯的細(xì)胞病變,血吸附檢查應(yīng)為陽性,熒光抗體檢測(cè)應(yīng)為陽性,判為試驗(yàn)成立。供試品如無細(xì)胞病變,血吸附檢查為陰性,且熒光抗體檢測(cè)為陰性,判定為符合要求。待測(cè)樣本如出現(xiàn)細(xì)胞病變,或血吸附檢查為陽性,或任何一種熒光抗體為陽性,則判定為不符合要求。

經(jīng)病毒滅活處理的牛血清,滅活前取樣檢測(cè)后若任何一項(xiàng)檢測(cè)顯示為陽性,不建議用于生產(chǎn)。除非可鑒別出污染的病毒,且病毒滅活工藝驗(yàn)證研究顯示其污染量可被有效滅活時(shí)方可使用,如果滅活前BVDV病毒檢測(cè)為陽性,滅活后還應(yīng)取樣采用敏感的方法檢測(cè)BVDV,結(jié)果陰性為符合要求。

未經(jīng)病毒滅活處理的牛血清若任何一項(xiàng)檢測(cè)顯示為陽性,則不得用于生產(chǎn)。

不能用感染試驗(yàn)檢測(cè)的牛源性病毒可采用核酸檢測(cè)法,但應(yīng)采用較大量的樣品提取核酸(如2550ml的血清樣本),并計(jì)算合并血清的檢測(cè)限。