細(xì)胞污染是生物實(shí)驗(yàn)室中常見的問題之一,輕則引起細(xì)胞狀態(tài)改變,降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性,重則會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞的死亡,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。因此,預(yù)防細(xì)胞污染,是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵點(diǎn)之一
如何控制細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的污染?本期內(nèi)容,為大家提供一些關(guān)鍵的方法和策略。
一、生物污染
細(xì)胞的體外生存環(huán)境,可以說(shuō)是“危機(jī)四伏"??諝庵衅≈鞣N肉眼難以捕捉的微生物,稍有不慎,細(xì)胞就會(huì)被感染。不僅如此,如果實(shí)驗(yàn)操作不夠規(guī)范,還有可能出現(xiàn)細(xì)胞交叉污染的情況。
1、細(xì)菌污染
細(xì)菌是一種原核細(xì)胞微生物,一般為微米級(jí)別。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中常見的污染菌為大腸桿菌、葡萄球菌、假單胞菌等。
細(xì)胞發(fā)生細(xì)菌污染后,有哪些癥狀?與其他污染相比,細(xì)菌污染在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中“發(fā)病"更為迅速,較容易被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)如下癥狀時(shí),基本可以斷定,細(xì)胞發(fā)生了細(xì)菌污染:
①細(xì)胞培養(yǎng)基在短時(shí)間內(nèi)迅速渾濁;
②靜置的培養(yǎng)液時(shí)不渾濁,但稍加震蕩,就有許多渾濁物漂起;
③顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂??;
④細(xì)胞停止生長(zhǎng)、出現(xiàn)大量死亡;
如果細(xì)胞不幸遭遇到了細(xì)菌污染的侵襲,該如何應(yīng)對(duì)呢?我們建議直接將細(xì)胞丟棄,并對(duì)培養(yǎng)環(huán)境消毒。國(guó)際上大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用Mycoplasma-off™噴霧劑(或濕巾),對(duì)超凈臺(tái)、培養(yǎng)箱等環(huán)境進(jìn)行消殺。
2、支原體污染
支原體(mycoplasma)是一類沒有細(xì)胞壁、高度多形性、部分可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的原核細(xì)胞型微生物,大小為0.3微米左右。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,顯微鏡很難捕捉到它們的身影,與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng),影響細(xì)胞生長(zhǎng),最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)偏差,當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)如下癥狀時(shí),基本可以斷定,細(xì)胞發(fā)生了支原體污染:
①生長(zhǎng)速率緩慢、活力下降、易脫壁;
②細(xì)胞形態(tài)改變;
③細(xì)胞易聚團(tuán);
④在顯微鏡下,可見培養(yǎng)液中產(chǎn)生大量碎片(培養(yǎng)基不渾濁);
⑤在培養(yǎng)過(guò)程中,培養(yǎng)液很快變黃(意味著培養(yǎng)液中有看不見的大量微生物繁殖,營(yíng)養(yǎng)被消耗);
由于支原體體型微小,在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,普通光學(xué)顯微鏡很難觀察到,只有在電鏡下才能拍到支原體的照片。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的支原體污染,會(huì)大量消耗培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)。98%會(huì)附著在細(xì)胞表面,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)生異常,甚至引起死亡,最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)生異常。
如果細(xì)胞被支原體污染,該如何處理?對(duì)與支原體污染的細(xì)胞,優(yōu)先考慮丟掉細(xì)胞,重新培養(yǎng)。
①對(duì)于非常珍貴的細(xì)胞株(不可再得的)國(guó)際上使用Mynox® Gold,做4周左右的支原體祛除持續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
②對(duì)于非常珍貴的細(xì)胞株或生物樣品(無(wú)法長(zhǎng)期培養(yǎng)的),可使用Mynox®,對(duì)細(xì)胞做3小時(shí)左右的祛除支原體處理,處理完畢,沖洗細(xì)胞,將樣品放入潔凈的培養(yǎng)液中,重新培養(yǎng)或保存即可。
③對(duì)于已經(jīng)進(jìn)行到中途的細(xì)胞實(shí)驗(yàn),如果將培養(yǎng)的大量細(xì)胞丟棄,會(huì)造成高昂的實(shí)驗(yàn)成本損失。對(duì)于這樣的情況,補(bǔ)救辦法如下:在培養(yǎng)液中加入10%的Zell Shield®(一種新型復(fù)合抗生素)。按照廠家建議的方法,配合處理細(xì)胞,培養(yǎng)4代以上,基本可祛除支原體污染。
④一些做原代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室,為了預(yù)防取原代細(xì)胞過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生支原體污染,實(shí)驗(yàn)人員也可以在培養(yǎng)液中加入10%的Zell Shield®(一種新型復(fù)合抗生素),培養(yǎng)4代以上,即可撤掉Zell Shield®,此過(guò)程可有效預(yù)防支原體污染的發(fā)生。
3、真菌污染
真菌是一類具真核和細(xì)胞壁的異養(yǎng)生物。真菌可以通過(guò)孢子延續(xù)種群,典型的營(yíng)養(yǎng)體為絲狀分支結(jié)構(gòu)??晌廴炯?xì)胞培養(yǎng)基的真菌種類繁多,最常見的有曲霉菌,白色念珠菌,酵母菌,黑霉菌,孢子菌等。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)上述癥狀時(shí),基本可以斷定,細(xì)胞發(fā)生了真菌污染:
①在細(xì)胞培養(yǎng)液中會(huì)形成淡黃色或白色的漂浮物,肉眼可見,但培養(yǎng)液在短期內(nèi)不變混濁;
②顯微鏡下可以看見細(xì)胞之間或是培養(yǎng)液中,有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀,樹枝狀或管狀菌絲;
③多數(shù)菌絲在高倍鏡下可以觀察到鏈狀排列的菌株,而念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形,散落在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長(zhǎng)。
細(xì)胞發(fā)生真菌污染時(shí),需要將細(xì)胞丟棄,并對(duì)培養(yǎng)環(huán)境消毒,國(guó)際上大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用Mycoplasma-off™噴霧劑,對(duì)超凈臺(tái)、培養(yǎng)箱等環(huán)境進(jìn)行消殺。
二、加強(qiáng)細(xì)胞間管理,是解決細(xì)胞污染真正有效的方法
匯總了各大實(shí)驗(yàn)室的工作流程:
1、在正式進(jìn)入細(xì)胞間前,需要在緩沖隔離間佩戴好細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室專用的防護(hù)用具:口罩、防護(hù)服、鞋套等,開始實(shí)驗(yàn)前,佩戴好手套。
2、定期使用Mycoplasma-off™噴霧劑(或濕巾),對(duì)工作區(qū)域消殺(建議半個(gè)月一次,但需根據(jù)細(xì)胞間實(shí)際使用頻率決定)。
3、每次實(shí)驗(yàn)開始前,和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用紫外線對(duì)細(xì)胞間進(jìn)行照射消毒,實(shí)驗(yàn)操作前用酒精或Mycoplasma-off™噴霧劑對(duì)操作人員的手套進(jìn)行噴涂消毒。
4、在水浴鍋或培養(yǎng)箱水槽的水中,加入0.5%的Water Shield™,可確保一個(gè)月內(nèi)水源不會(huì)變成支原體、真菌或細(xì)菌的污染源。
5、如果細(xì)胞間內(nèi),發(fā)生多株細(xì)胞的聯(lián)合的支原體污染情況,建議在做上述1-4的操作的同時(shí),將液氮罐,也用Mycoplasma-off™噴霧劑(或濕巾)進(jìn)行消殺,并更換潔凈的液氮,(液氮罐中凍存的細(xì)胞發(fā)生支原體污染,也會(huì)在液氮中引起污染的的傳播)。
上述內(nèi)容只分析了生物因素污染,在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中,可能還會(huì)發(fā)生物理或化學(xué)污染,請(qǐng)自行排除,本文不再贅述。
三、使用高品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)試劑,降低細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)
胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基補(bǔ)充物,以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和健康。選擇高品質(zhì)的胎牛血清,可以盡可能降低細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)。
高品質(zhì)的胎牛血清,血源清晰、通過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè),并在檢測(cè)報(bào)告上,表明批次、內(nèi)毒素含量、無(wú)菌檢測(cè)和病原檢測(cè)情況、蛋白含量等指標(biāo),清晰且明確。以科研人常用的Ausbian進(jìn)口特級(jí)胎牛血清為例,澳洲血源,內(nèi)毒素含量≤3EU/ml,無(wú)菌檢測(cè)和病原檢測(cè)結(jié)果均為“未檢出"病毒和細(xì)菌,蛋白含量也有注明,品質(zhì)如何,一目了然!