CRISPR是原核生物基因組內(nèi),一段短的重復(fù)序列,天然存在于細菌和古細菌中。在病毒和細菌的“進化斗爭史"過程中,病毒可以把自身的基因整合到細菌中,進一步利用細菌的胞內(nèi)“工具",幫助自己完成基因的復(fù)制過程;而細菌為了將病毒入侵帶來的非己基因清除,進化出CRISPR-Cas9系統(tǒng)。利用該系統(tǒng),細菌把病毒基因從自己的基因組上剪切掉。從整個過程來看,CRISPR-Cas9系統(tǒng)是細菌的“免疫系統(tǒng)",是抵抗病毒等外源遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。
CRISPR-Cas9系統(tǒng)包含guide RNA,也被稱為single guide RNA,sgRNA,以及有核酸內(nèi)切酶活性的Cas 9蛋白。
其中sgRNA包含了與目標DNA上特定基因序列互補的一段RNA序列,以及用于識別Cas9的一段序列。Cas9是一種酶,它充當CRISPR系統(tǒng)的“剪刀"。Cas9能夠被程序性地引導(dǎo)到目標DNA上,并在特定的DNA序列位置切割DNA鏈。
在實驗過程中,將sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合,形成一個復(fù)合物。這個復(fù)合物能夠通過sgRNA的序列精確定位到目標基因的位置,并引導(dǎo)Cas9切割目標DNA。一旦DNA被切割,細胞的自身修復(fù)機制會介入,修復(fù)DNA損傷。DNA修復(fù)過程通常涉及兩種主要機制。非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)通常導(dǎo)致隨機的插入或刪除DNA片段,從而引起基因突變。同源重組(homology-directed repair,HDR)允許精確地插入新的DNA序列,實現(xiàn)精確的基因編輯。
CRISPR的成功應(yīng)用,有諸多關(guān)鍵點,其中一項,就是對于實驗環(huán)境中,核酸污染的控制。在PCR實驗室中,DNA污染很難清除。即使只有一個污染的DNA分子被檢測到,也會使整個PCR檢測過程出現(xiàn)誤差。為確保PCR試驗數(shù)據(jù)準確,預(yù)防DNA或RNA交叉污染,PCR實驗室大多會常備DNA/RNA污染清除劑。德國MB公司生產(chǎn)的PCR Clean™,可有效地降解大多數(shù)表面上(輕質(zhì)金屬或有色金屬除外)的擴增子,質(zhì)粒或基因組DNA和RNA。該產(chǎn)品還能有效地去除DNA酶和RNA酶。使用便捷,可直接噴灑在物體表面。保護實驗人員,避免接觸DNA污染。非堿性,無致癌性,成分安全。