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新方法推動(dòng)『DNA殘留檢測(cè)』進(jìn)入新篇章

更新時(shí)間:2023-07-25  |  點(diǎn)擊率:478

在分子生物學(xué)領(lǐng)域中,準(zhǔn)確測(cè)量DNA或RNA分子的數(shù)量是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。

傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在這方面發(fā)揮了重要作用,但它存在著一些局限性。為了解決傳統(tǒng)PCR技術(shù)的限制,并提高分子檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度,數(shù)字PCR(dPCR)應(yīng)運(yùn)而生。

本文將追溯dPCR的發(fā)展歷程,探討其在分子生物學(xué)研究中的重要性與相關(guān)應(yīng)用。


dPCR技術(shù)的起源

一般認(rèn)為,早期的數(shù)字PCR可以追溯到20世紀(jì)90年代,當(dāng)時(shí)研究人員使用微小的PCR反應(yīng)體積來檢測(cè)單個(gè)分子。這種方法被稱為限制性酶消化PCR(RE-PCR),它使用限制性酶將DNA分子切成小片段,然后對(duì)這些小片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

在二十世紀(jì)末,研究人員開始使用微流控技術(shù)來制造微小的反應(yīng)體積。這種方法被稱為微滴數(shù)字PCR(ddPCR),它可以將單個(gè)DNA分子分隔成數(shù)百萬(wàn)個(gè)微小的反應(yīng)體積中。這種技術(shù)可以提高PCR反應(yīng)的靈敏度和精確性,并且可以用于檢測(cè)罕見的突變和低拷貝數(shù)的DNA序列。


dPCR的原理與優(yōu)勢(shì)

dPCR是一種基于單分子級(jí)別的PCR擴(kuò)增技術(shù)。與傳統(tǒng)的PCR相比,dPCR將反應(yīng)混合物分割成更小的單元,使每個(gè)單元中只有一個(gè)分子。通過限定性稀釋,可以確定反應(yīng)體系中的模板分子數(shù)。然后,利用熒光標(biāo)記或探針技術(shù)檢測(cè)每個(gè)單元中是否存在目標(biāo)序列,并計(jì)算目標(biāo)分子的絕對(duì)數(shù)量。

dPCR的優(yōu)勢(shì)dPCR在許多方面優(yōu)于傳統(tǒng)PCR。首先,作為一種絕對(duì)定量的方法,dPCR能夠提供更高的靈敏度和準(zhǔn)確性,尤其對(duì)于低豐度的目標(biāo)分子。其次,由于每個(gè)單元都是獨(dú)立擴(kuò)增和檢測(cè)的,因此dPCR對(duì)于抑制物的影響更小,結(jié)果更可靠。此外,dPCR還具有較寬的動(dòng)態(tài)范圍和更好的檢測(cè)限度,能夠檢測(cè)罕見突變和微小的拷貝數(shù)變化。


?dPCR的應(yīng)用

dPCR已廣泛應(yīng)用于宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)、基因表達(dá)分析、突變檢測(cè)、病原體檢測(cè)和液體活檢等領(lǐng)域。在基因表達(dá)研究中,dPCR能夠準(zhǔn)確測(cè)量不同基因的表達(dá)水平,并發(fā)現(xiàn)低豐度的轉(zhuǎn)錄變異。在突變檢測(cè)中,dPCR能夠檢測(cè)罕見突變,對(duì)于腫瘤早期診斷和治療選擇具有重要意義。在病原體檢測(cè)方面,dPCR的高靈敏度和準(zhǔn)確性使其成為檢測(cè)感染病原體的理想工具。在液體活檢中,dPCR可以通過檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA來監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)變化,為腫瘤的診斷和治療提供重要依據(jù)。

未來,dPCR可能會(huì)被更廣泛地應(yīng)用于許多領(lǐng)域,包括醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)和食品安全等。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,dPCR可以用于檢測(cè)癌癥和其他疾病的DNA標(biāo)記物,以及監(jiān)測(cè)藥物治療的效果;在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域,dPCR可以用于檢測(cè)水和土壤中的微生物和污染物。在食品安全領(lǐng)域,dPCR可以用于檢測(cè)食品中的病原體和污染物。