無(wú)論是歐洲藥典、日本藥典、還是中國(guó)藥典,均對(duì)細(xì)胞相關(guān)的臨床項(xiàng)目有明確的支原體檢測(cè)指標(biāo)的要求。藥典中還指出,核酸法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證后,可替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法與指示細(xì)胞法進(jìn)行檢測(cè)。
PART.01
qPCR檢測(cè)支原體的技術(shù)原理
通過(guò)擴(kuò)增高度保守的rRNA操縱子,或者更準(zhǔn)確地說(shuō),擴(kuò)增支原體基因組中的16S rRNA編碼區(qū),可以特異性地檢測(cè)支原體。在FAM通道檢測(cè)支原體特異性擴(kuò)增片段。在HEX通道檢測(cè)內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照的擴(kuò)增。它能特異性檢測(cè)所有導(dǎo)致細(xì)胞污染的柔膜體物種。真核DNA不會(huì)被擴(kuò)增。通過(guò)內(nèi)部對(duì)照,可檢測(cè)PCR抑制劑的存在或不正確的DNA提取引起的假陰性結(jié)果。
樣本通常為細(xì)胞培養(yǎng)上清液,如檢測(cè)其他組織或細(xì)胞樣本,需要對(duì)樣本進(jìn)行額外的處理,例如蛋白酶消化等過(guò)程。檢測(cè)程序通??稍?小時(shí)內(nèi)完成。
PART.02
qPCR用于支原體檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)
快速簡(jiǎn)便
與動(dòng)輒30天起步的傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比,qPCR技術(shù)的反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較短,通常在幾小時(shí)內(nèi)就可以完成,大大縮短了用于檢測(cè)對(duì)的時(shí)間成本。
靈敏度高
qPCR技術(shù)可以在非常低的病原體濃度下進(jìn)行檢測(cè),這種高靈敏度使得qPCR能夠有效地檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)體系、實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)流程中,是否發(fā)生支原體污染,即使在污染的早期階段,也能夠得到準(zhǔn)確的結(jié)果。
并且配合靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行靈敏度的驗(yàn)證,進(jìn)一步完善方法學(xué)驗(yàn)證的流程。
以德國(guó)Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP為例,檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。
特異性強(qiáng)
qPCR技術(shù)可以使用特異性引物和探針來(lái)選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)支原體的DNA序列。通過(guò)設(shè)計(jì)引物和探針與目標(biāo)序列高度匹配,可以避免非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生,從而提高檢測(cè)的特異性。
以德國(guó)Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP為例,一次檢測(cè)即可涵蓋所有常見(jiàn)易感染細(xì)胞的支原體物種(包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體)。與細(xì)菌和真核DNA無(wú)交叉反應(yīng)。
定量能力
與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比,qPCR可以提供定量信息。通過(guò)利用熒光探針或DNA染料,可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度,從而得到目標(biāo)序列的定量結(jié)果。這種定量能力使得qPCR技術(shù)在支原體載量的測(cè)定和污染進(jìn)程的監(jiān)測(cè)中非常有用。
PART.03
支原體檢測(cè)試劑盒
德國(guó)MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒(均為探針?lè)z測(cè)):Venor Gem qEP,有以下優(yōu)點(diǎn):
①遵循歐洲藥典流程要求
②高特異性。一次檢測(cè)即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種(涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體),根據(jù)序列一致性,至少可以檢測(cè)到107種支原體物種。操作簡(jiǎn)單,易于觀察(使用MB的試劑盒,多種支原體物種均為陽(yáng)性,其他微生物或真核細(xì)胞均為陰性,無(wú)交叉反應(yīng))。
③高靈敏度。MB公司的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒經(jīng)典法檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。
④各類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品配套齊全
10CFU/100CFU的敏感度測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)品,便于方法學(xué)驗(yàn)證。
支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA,便于特異性驗(yàn)證。
支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品,便于最后定量檢測(cè)。