生物醫(yī)藥與支原體檢測(cè)

在疫苗、生物藥、細(xì)胞治療領(lǐng)域等領(lǐng)域，支原體檢測(cè)發(fā)揮著重要作用，該項(xiàng)檢測(cè)是檢查藥物是否遭受外源因子污染的有效手段，是保證產(chǎn)品質(zhì)量的重要質(zhì)控途徑。

我國(guó)藥典中有提到，在一些領(lǐng)域需要進(jìn)行支原體檢測(cè)。包括主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、生產(chǎn)終末細(xì)胞、檢定細(xì)胞、病毒種子批和病毒收獲液、細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料如培養(yǎng)基、胰酶、臨床治療用干細(xì)胞和免疫細(xì)胞、新生牛血清以及雜交瘤細(xì)胞等。

常見(jiàn)的支原體檢測(cè)方法有以下幾種：

• 培養(yǎng)法

• 指示細(xì)胞法

• 核酸法

• ELISA法

琳瑯滿目的檢測(cè)方法這么多，究竟該怎么選？本期內(nèi)容盤(pán)點(diǎn)了幾種常見(jiàn)的支原體檢測(cè)方法，希望能幫助小伙伴們選擇適合自己的方法。

方法一：分離培養(yǎng)法

方法

簡(jiǎn)單來(lái)講，就是從樣品細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，接種到適宜支原體生長(zhǎng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上生長(zhǎng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。

優(yōu)點(diǎn)

操作規(guī)范的情況下，這種方法很少會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，檢測(cè)精確度很高，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。

該方法也是《美國(guó)藥典》中認(rèn)可的支原體檢測(cè)方法之一。

缺點(diǎn)

檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。

還有一點(diǎn)就是，培養(yǎng)法無(wú)法對(duì)曾經(jīng)感染過(guò)的樣品做出判斷。

另一方面，盡管可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M. Hyorhinis。因此，該方法能鑒定的支原體種類有限，成為它的另一個(gè)缺點(diǎn)。

方法二：指示細(xì)胞法

方法

將供試品接種于指示細(xì)胞（無(wú)污染標(biāo)準(zhǔn)化Vero 細(xì)胞或經(jīng)國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞，供試品應(yīng)對(duì)該細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響）中培養(yǎng)后，用特異熒光染料進(jìn)行染色，支原體中的核酸也可以被著色。

因此，如果待檢測(cè)細(xì)胞中含有支原體，那么就會(huì)導(dǎo)致指示細(xì)胞被感染，進(jìn)而在細(xì)胞膜或培養(yǎng)基等處發(fā)現(xiàn)藍(lán)色熒光（支原體附著在細(xì)胞膜上，也有可能游離在細(xì)胞培養(yǎng)基中）。

優(yōu)點(diǎn)

適用于一些不易培養(yǎng)的支原體，如豬鼻支原體，分離培養(yǎng)法對(duì)該支原體檢測(cè)并不可靠，但可用DNA染色法準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)。屬于《美國(guó)藥典》中認(rèn)可的方法。

缺點(diǎn)

時(shí)間較長(zhǎng)，從Vero細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，再到收集上清后再次培養(yǎng)，有時(shí)甚至需要十幾天時(shí)間

存在假陽(yáng)性和假陰性的可能：如一些死亡細(xì)胞釋放出來(lái)的DNA會(huì)被染成藍(lán)色，出現(xiàn)假陽(yáng)性；或是由于熒光過(guò)若而出現(xiàn)假陰性使結(jié)果出現(xiàn)偏差，因此使用這個(gè)方法需要一定的經(jīng)驗(yàn)。

方法三：核酸法

方法

通過(guò)對(duì)樣品中可能存在的支原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，來(lái)判斷樣品是否被支原體污染。常用的核酸法主要有常規(guī)PCR法和熒光定量PCR法（qPCR），德國(guó)MB均有針對(duì)這兩種方法設(shè)計(jì)的高效試劑盒。

優(yōu)點(diǎn)

目前使用較為廣泛，擁有檢測(cè)速度快、高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)，還可以選配支原體和細(xì)菌DNA、支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)進(jìn)行特異性驗(yàn)證、定量檢測(cè)。

《美國(guó)藥典》中指出，核酸法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，可替代培養(yǎng)法以及指示細(xì)胞法這兩種經(jīng)典方法。

缺點(diǎn)

qPCR的檢測(cè)試劑盒成本相對(duì)較高。

總結(jié)

在選擇支原體檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)從實(shí)際的應(yīng)用場(chǎng)景出發(fā)。

如果只是想判斷樣品是否被支原體污染，無(wú)需出具報(bào)告等專業(yè)說(shuō)明，使用德國(guó)MB的常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒即可。

如果是疫苗、生物藥等產(chǎn)品的上市前檢測(cè)，需要出具專業(yè)的報(bào)告，則需要用到德國(guó)MB的qPCR支原體檢測(cè)試劑盒，同時(shí)配套使用標(biāo)準(zhǔn)品，完成方法學(xué)驗(yàn)證，為了提高準(zhǔn)確性和靈敏度，建議配合支原體DNA提取試劑盒一起使用。