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都是qPCR,結果為何差距這么大?

更新時間:2023-03-25  |  點擊率:645

qPCR技術是分子生物實驗中,常見的一種幾首手段。使用Quantitative Real Time PCR擴增裝置即qPCR儀,通過不同的化學原理和數(shù)學原理,在PCR過程中實時監(jiān)測核酸擴增產(chǎn)物的技術。qPCR實現(xiàn)了通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。

qPCR的熒光標記方法分為以添加熒光基團核酸探針為主的熒光探針法,以綠色染料為主的熒光染料嵌合法。


利用不同化學原理設計的qPCR實驗,

實驗結果可能會產(chǎn)生不小的差距!

本期內容,我們一起來聊聊這兩種常見的qPCR熒光標記方法有何不同,幫助大家選擇更符合自身實驗需求的方法。


熒光探針法

簡單來說,應用該原理的熒光探針,是由熒光基團+DNA寡核苷酸+淬滅基團構成。

探針由5’端標記有熒光報告基團、目標基因特異性結合的寡核苷酸序列以及3’端標記有淬滅基團以及與組成。

自然狀態(tài)下,探針完整,熒光報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,儀器不會檢測到熒光信號。

當存在目標序列時,目標DNA變性解鏈,熒光探針特異性結合到目標基因處。引物也結合在目標基因上,Taq酶又名DNA聚合酶,能將核苷酸添加到引物中,引物開始延伸。

Taq酶還具有5’-3’核酸外切酶活性。當引物延伸至探針結合處,可將探針水解,使熒光報告基團和淬滅基團分離,進而被qPCR儀檢測到熒光信號,熒光信號的強度與擴增得到的DNA的濃度成正比。

熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴增曲線",通過熒光信號的強度反映出體系中雙鏈DNA的濃度。

熒光探針有許多不同種類,以應對不同的實驗需求,該方法特異性高,已經(jīng)被廣泛地應用于基因檢測、病原體和病毒檢測、疾病耐藥基因篩查等領域。


德國MB支原體檢測試劑盒

Venor®Gem qEP

應用熒光探針法對支原體DNA進行檢測,準確率高,使用方便。

熒光染料嵌合法

該方法用到一種非特異性雙鏈DNA熒光染料,被激發(fā)后,顯示為綠色熒光。

該染料以一種非特異性方式,與雙鏈DNA(dsDNA)雙螺旋小溝區(qū)域相結合。游離的染料熒光信號微弱,在進行qPCR擴增生成dsDNA時,染料逐漸與dsDNA結合,熒光信號被很大程度放大,熒光信號的強度與擴增得到的dsDNA的濃度成正比。

熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴增曲線",通過熒光信號的強度反映出體系中dsDNA的濃度。

德國MB支原體qPCR檢測試劑盒,應用熒光探針法原理,對支原體DNA進行檢測,具有特異性更強、靈敏度更高、可重復性更佳的特點。

支原體檢測方面,通過歐洲藥典和日本藥典方法學檢驗。