總的原則：無菌操作、保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性

按時(shí)間順序整理

1、 細(xì)胞房和生物安全柜（或超凈工作臺(tái)）先開紫外照射30min。作用：對(duì)環(huán)境滅菌（空氣）。（備注：如果著急，至少也要開15分鐘）

在做實(shí)驗(yàn)之前考慮好需要哪些物品。開始照射之前，將所需要用到的物品都放到生物安全柜（或超凈工作臺(tái)）里面。

常用移液槍或電動(dòng)移液器等，需要在工作臺(tái)上放置一套專用設(shè)備。

細(xì)胞培養(yǎng)箱一般都已經(jīng)調(diào)整好。定期留意一下二氧化碳是否足夠。不夠及時(shí)更換。

2、 顯微鏡需要定期消毒酒精擦拭。注意：顯微鏡一般都放在細(xì)胞房。

3、 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)之前，首先給自己帶上拖鞋、頭套，口罩，實(shí)驗(yàn)服，手套（手套帶雙層）。注意：手套要將袖口套進(jìn)去。實(shí)驗(yàn)服、拖鞋最好是細(xì)胞房專用。

4、 開始操作之前先觀察細(xì)胞。

首先觀察細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色?，F(xiàn)在的細(xì)胞培養(yǎng)液通常都放有酸堿指示劑（絕大部分是酚紅）。細(xì)胞在培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中，不斷在培養(yǎng)液上清中累積酸性物質(zhì)，時(shí)間長(zhǎng)了，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色（同時(shí)培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡）。

其次鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是否良好，是否需要傳代。如果生長(zhǎng)狀態(tài)不好，需要對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行調(diào)整（一般是加大血清濃度）。過于密集出現(xiàn)大片融合或太密集而導(dǎo)致細(xì)胞脫落，則進(jìn)行傳代。

如果長(zhǎng)勢(shì)良好，且細(xì)胞培養(yǎng)液顏色未發(fā)生變化，可以酌情進(jìn)行1/2、 1/3、1/4換液，也可以全換液。總之，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。

5、 細(xì)胞培養(yǎng)預(yù)準(zhǔn)備：

首先是準(zhǔn)備各種溶液。

第一是配制溶液過程中要用到的水。水用純水，高壓滅菌之后，再去內(nèi)毒素。去內(nèi)毒素方法很多，簡(jiǎn)單可以放在烘箱180度3小時(shí)?；蛘哌^去內(nèi)毒素的柱子后，高壓滅菌。

第二，各種溶液滅菌：

抗生素用去內(nèi)毒素水配制后，直接過濾除菌（過0.22u濾頭）。可以用一次性無菌注射器過一次性0.22u濾頭。

現(xiàn)在用的培養(yǎng)液，如果是商業(yè)化液體培養(yǎng)基，不用處理。如果是粉末，需要用去內(nèi)毒素水在生物安全柜（或超凈工作臺(tái)）進(jìn)行配制，再過濾除菌?？梢韵扰錆饪s液（如10×），過濾除菌后。再用滅菌去內(nèi)毒素水稀釋成1×培養(yǎng)液。

第三，*培養(yǎng)液的配制：

培養(yǎng)液加上合適比例的血清即可。但血清一般保存于－20℃，一般解凍是放在4℃冰箱解凍，耗時(shí)長(zhǎng)，而且必須解決*之后，才能進(jìn)行*培養(yǎng)基的配制。所以要提前幾個(gè)小時(shí)就將血清從－20℃轉(zhuǎn)入4℃，以期*解凍。當(dāng)然如果這一次就需要用完的話（是指用這些血清配制的培養(yǎng)液都用完），也可以放到37℃解凍。

第四，最重要的是保證過程中無菌。

液體必須要分裝。無論過程中用到的培養(yǎng)液、胰酶、血清、PBS、生理鹽水、抗生素盡量分裝。分裝是為了防止污染。如果操作有誤，僅能威脅到其中一支，而非整個(gè)。

培養(yǎng)液、血清、PBS、生理鹽水分裝為20mL、50mL或100mL/管

胰酶、抗生素可分裝為1mL/管。

分裝最好先于細(xì)胞操作

第五，操作之前，培養(yǎng)液先放到37度的細(xì)胞培養(yǎng)箱里復(fù)溫。原因：盡量減少對(duì)細(xì)胞的刺激。低溫對(duì)于細(xì)胞也是一個(gè)刺激因素。

第六，操作之前，大腦先過一遍此次操作所需要用到的所有用具。將所有用具先放到無菌臺(tái)面上。減少拿入拿出的動(dòng)作，保證無菌。（如果萬一發(fā)現(xiàn)少拿了什么，也不要緊，再加上就是。如果是槍頭盒、移液管等用具，最好先用消毒酒精噴一下）。

第七，操作之前，帶著的手套先噴消毒酒精。然后再進(jìn)入工作臺(tái)。等一分鐘，等手套上的酒精揮發(fā)之后再進(jìn)行操作。

6、 細(xì)胞培養(yǎng)操作過程；

7、 收拾工作臺(tái)。物品歸位，倒出垃圾。再開紫外照射30min

8、 其它注意事項(xiàng)：

第一，經(jīng)常觀察。最好是每天都顯微鏡下看一看，確定細(xì)胞狀態(tài)。然后該換液換，該傳代傳，不用理會(huì)的就原樣放回去。如果好幾天都不想理會(huì)，可以放不*培養(yǎng)基，或者低血清濃度的培養(yǎng)液，維持細(xì)胞生存，但不增殖。

第二，是否加抗生素。這個(gè)視情況而定。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，是要求盡量少添加不相關(guān)的雜質(zhì)?？股貙?duì)于細(xì)胞來說，也是一種負(fù)擔(dān)。但如果環(huán)境比較污染，直接添加好了。好比沒病不用吃藥，感冒了還是要吃藥；嬰兒沒病但還是要打疫苗。

第三，胎牛血清的解凍。血清一般保存于－20℃，要放在4℃冰箱解凍，耗時(shí)長(zhǎng)，500mL要好幾個(gè)小時(shí)，我們經(jīng)常是頭天離開實(shí)驗(yàn)室之前放到4℃冰箱，過夜。所以經(jīng)常分裝成10mL或者20mL。這樣，上午放到4℃冰箱，下午就可以用了。

第二，是否一定要細(xì)胞房。以及是否要*嚴(yán)格的遵守種種器具專用。這個(gè)吧，見仁見智。凡所有種種措施及設(shè)備都是為了保證培養(yǎng)操作過程中無菌，減少感染的機(jī)率；專用試劑耗材保證無菌無內(nèi)毒素。細(xì)胞房也是這么一個(gè)措施而已，其它試劑耗材也是；我們沒有專門的細(xì)胞房也這么養(yǎng)。

剛開始我們實(shí)驗(yàn)室也是沒有專用的生物安全柜和細(xì)胞房，拖鞋什么的也沒辦法專用，沒有加抗生素，照樣養(yǎng)得好好的。但是，交叉養(yǎng)，還是需要注意，一是時(shí)間上分隔開來：每天細(xì)胞培養(yǎng)先操作。其它細(xì)菌之類操作靠后，且操作后消毒酒精臺(tái)面消毒，紫外照射1小時(shí)。二是其它操作要小心，避免帶入污染。當(dāng)然，如果有必要加抗生素，還是盡早加，比細(xì)胞污染了再去搶救要來得好。

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