癌癥是對(duì)人類(lèi)健康威脅最大的疾病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計(jì)，2018 年全球新發(fā)癌癥病例達(dá)到 1,807 萬(wàn)例，其中肺癌 209 萬(wàn)例，發(fā)病率名lie前茅。

中國(guó)癌癥新發(fā)患者人數(shù)也在逐年增加，根據(jù)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的全國(guó)癌癥數(shù)據(jù)，2015 年全國(guó)新發(fā)惡性腫瘤病例數(shù)約 392.9 萬(wàn)例，肺癌位居發(fā)病shou位。

肺癌患病率逐年攀升，轉(zhuǎn)移是肺癌高死亡率的主要原因之一，嚴(yán)重危害人類(lèi)公共健康。

肺癌是如何轉(zhuǎn)移的？

哪些因素會(huì)影響肺癌轉(zhuǎn)移？

如何斷了癌細(xì)胞后路，避免其轉(zhuǎn)移？

這些問(wèn)題一直困擾著研究人員。

近日，《Theranostics》上發(fā)表了一篇標(biāo)題為：“Proteomic analysis of lung cancer cells reveals a critical role of BCAT1 in cancer cell metastasis"的論文，或許可以在一定程度上回答上述問(wèn)題。

濃縮精華版：

研究人員發(fā)現(xiàn)：在轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞和肺癌患者的轉(zhuǎn)移性組織中，分支鏈氨基酸代謝的關(guān)鍵酶BCAT1蛋白水平呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)狀態(tài)。通過(guò)數(shù)據(jù)分析分析得出結(jié)論：BCAT1轉(zhuǎn)錄的增加，與肺癌患者總生存率較低之間存在關(guān)聯(lián)性。

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在過(guò)去的十年中，基因組測(cè)序越來(lái)越多地被應(yīng)用到轉(zhuǎn)移性腫瘤突變譜的研究中 [1，2]。已有一些研究，對(duì)肺癌患者標(biāo)本進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)基因組學(xué)研究，繪制了呈現(xiàn)了原發(fā)腫瘤相對(duì)于腫瘤旁“正常"組織的蛋白質(zhì)組圖 [3，4]。然而，關(guān)于轉(zhuǎn)移性肺癌的蛋白質(zhì)組水平的相關(guān)研究仍然不足。

我們已經(jīng)知道，氨基酸代謝在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

氨基酸密碼子對(duì)照表

支鏈氨基酸(BCAA)到α-酮戊二酸(α-KG)的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，由胞質(zhì)BCAT1和線(xiàn)粒體BCAT2兩種類(lèi)型的bcat基因催化。該反應(yīng)產(chǎn)生谷氨酸，而谷氨酸又可以被腫瘤細(xì)胞優(yōu)先利用以促進(jìn)生存[5]。

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由此得到的支鏈酮酸(BCKA)進(jìn)一步分解為乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，它們是TCA循環(huán)的中間體[6]。BCAT1的過(guò)表達(dá)與髓樣白血病[7]、膠質(zhì)瘤[8]和非小細(xì)胞肺癌[9]的癌癥進(jìn)展有關(guān)，而增加BCAA攝取對(duì)于維持NSCLC[10]的腫瘤發(fā)生很重要。然而，BCAT1的表達(dá)過(guò)程，是否在轉(zhuǎn)移性腫瘤中出現(xiàn)紊亂？在潛在的遷移過(guò)程中發(fā)揮作用？這些目前尚不清楚。

為了確定與肺癌轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，研究人員用到了一種同位素標(biāo)記(SILAC：細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)條件下，用含有輕、重同位素標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，若干代后，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被穩(wěn)定標(biāo)記上同位素)的定量質(zhì)譜分析。

利用原發(fā)性肺腺癌A549細(xì)胞系(zhi定L0)和L0細(xì)胞進(jìn)行了三輪BALB/c Nude小鼠體內(nèi)選擇，產(chǎn)生脊柱轉(zhuǎn)移細(xì)胞(zhi 定L2和L6)[11]。然后，分別在“輕、中、重"三種同位素標(biāo)記的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，穩(wěn)定標(biāo)記后進(jìn)行質(zhì)譜定量分析。

得到結(jié)果1

• 轉(zhuǎn)移細(xì)胞顯示出與原代細(xì)胞不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。相對(duì)于L0細(xì)胞，L6細(xì)胞中有74個(gè)蛋白、L2中有86個(gè)蛋白發(fā)生了顯著變化。

• 在顯著改變的蛋白質(zhì)中，33個(gè)在兩種轉(zhuǎn)移細(xì)胞系(L2和L6)中出現(xiàn)重疊。

• 顯著富集的通路是氨基酸代謝過(guò)程（1C-D）BCAT1, BCAA代謝速率限制酶，是轉(zhuǎn)移細(xì)胞中最一致的上調(diào)蛋白。并且，上調(diào)蛋白的mRNA水平也升高。

隨后，作者又比較分析了四對(duì)，來(lái)自腫瘤患者樣本的原發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)。

采用串聯(lián)質(zhì)譜(TMT)標(biāo)記和質(zhì)譜定量分析方法檢測(cè)蛋白表達(dá)，利用TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

得到結(jié)果2

• 鑒定出14個(gè)變化顯著的蛋白。其中大部分改變的蛋白參與免疫反應(yīng)通路，包括干擾素- γ和PPAR信號(hào)通路。這些改變的蛋白也存在于先前SILAC質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)庫(kù)中。

• 患者的總生存期(OS, n = 241)與BCAT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān) ，表明，BCAT1可能是肺癌進(jìn)展的一個(gè)弱預(yù)后標(biāo)志物。

接著，研究人員利用A549細(xì)胞系，進(jìn)行了一系列細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)以及分子實(shí)驗(yàn)：Western blot、trans-well、RNA干擾等，以及小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究BCAT1在轉(zhuǎn)移中的作用。

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得到結(jié)果3

• 與使用原代和轉(zhuǎn)移性A549細(xì)胞株的SILAC蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，Western blot檢測(cè)BCAT1發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中顯著增加。

• L2和L6細(xì)胞的遷移能力明顯高于原代L0細(xì)胞，說(shuō)明轉(zhuǎn)移性更高。

• 穩(wěn)定表達(dá)shRNA對(duì)抗BCAT1 (shBCAT1)的L2和L6細(xì)胞，并進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。表達(dá)shBCAT1的細(xì)胞的遷移速度明顯慢于表達(dá)重組shRNA的對(duì)照細(xì)胞。

• 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組細(xì)胞相比，接種表達(dá)shBCAT1的L6細(xì)胞的小鼠的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移率降低。

• 對(duì)主要轉(zhuǎn)移部位(股骨和脛骨)的Micro-CT分析顯示，接種轉(zhuǎn)移細(xì)胞的小鼠有嚴(yán)重的骨性侵蝕(與L6和L0細(xì)胞相比)，而接種表達(dá)shBCAT1的轉(zhuǎn)移細(xì)胞的小鼠骨性侵蝕小得多。

• 最終得出結(jié)論：敲除BCAT1后，體外轉(zhuǎn)移的L2和L6細(xì)胞遷移能力減弱，體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移的嚴(yán)重程度大大降低，幾乎達(dá)到L0水平。BCAT1的過(guò)表達(dá)可能驅(qū)動(dòng)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，而降低BCAT1的表達(dá)抑制了癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。

為了深入了解BCAT1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的機(jī)制，研究人員檢測(cè)了與干細(xì)胞和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因的表達(dá)。

得到結(jié)果4

• 在L2和L6細(xì)胞中，干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX2在mRNA和蛋白水平均顯著升高。

SOX2是維持胚胎干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞可塑性的轉(zhuǎn)錄因子，它的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了肺癌的轉(zhuǎn)移。在已有研究中，SOX2的表達(dá)增加可能會(huì)使L0細(xì)胞進(jìn)入低分化狀態(tài)，遷移能力增加。

文章作者從先前的研究[11]中重新分析了這些A549細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)。

得到結(jié)果5

• SOX2下游的許多基因在L2和L6細(xì)胞中均顯著上調(diào)，包括Wnt信號(hào)基因NOTCH3、DVL1、DVL2和致癌基因KLF4。

• 與SOX2相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，包括FOXK1和FOXC1，增加了表達(dá)。

• 顯著富集的通路是氨基酸代謝過(guò)程（1C-D）BCAT1, BCAA代謝速率限制酶，是轉(zhuǎn)移細(xì)胞中最一致的上調(diào)蛋白。并且，上調(diào)蛋白的mRNA水平也升高。

然而，在先前的SILAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞中包括CTNNB1和DVL2在內(nèi)的Wnt信號(hào)蛋白減少。He等人之前的一項(xiàng)研究也表明，過(guò)表達(dá)SOX2可能通過(guò)上調(diào)A549細(xì)胞[12]中的GSK3β，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制。

因此，作者假設(shè)SOX2通過(guò)β-catenin抑制Wnt信號(hào)，維持轉(zhuǎn)移細(xì)胞的未分化狀態(tài)。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員用幾種不同的方式：熒光成像、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、Real-time PCR，確定了BCAT1在轉(zhuǎn)移性A549細(xì)胞中促進(jìn)了SOX2的表達(dá)，這一新的途徑可能是肺癌細(xì)胞干性的重要調(diào)控因子。

得到結(jié)果6

• α-KG  水平確實(shí)在L2和L6細(xì)胞中降低，而降低BCAT1的表達(dá)部分恢復(fù)了α-KG  水平。

• 谷氨酸、KIV和BCAAs在轉(zhuǎn)移細(xì)胞中積累。

• 隨著降低BCAT1的表達(dá)，這些氨基酸和酮酸的水平也會(huì)降低。由于α-KG是DNA去甲基化酶TET2的輔助因子，降低α-KG濃度可能導(dǎo)致靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化，從而沉默這些基因。

• 檢測(cè)了DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)L2和L6細(xì)胞中5-甲基脫氧胞嘧啶(5mdC)顯著升高，表明DNA有整體高甲基化的趨勢(shì)。

• 在表達(dá)sh-BCAT1的L2和L6細(xì)胞中，5mdC大量減少。此外，在L2和L6細(xì)胞中觀(guān)察到組蛋白甲基化增加的現(xiàn)象。

TET2調(diào)控的許多基因中有編碼micro-RNAs的基因，已有研究表明miR200家族成員是SOX2的負(fù)調(diào)控因子。

這提出了一種可能性：

即bcat介導(dǎo)的α-KG的減少導(dǎo)致miR200家族成員的高甲基化，并解除了SOX2的翻譯抑制。

分析顯示miR200c的表達(dá)與BCAT1呈負(fù)相關(guān)。

有報(bào)道稱(chēng)：miR-200c表達(dá)的丟失在NSCLC中誘導(dǎo)了侵襲性表型。研究人員測(cè)量了miR200c，以及其他后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

得到結(jié)果7

• miR200c在L2和L6細(xì)胞中觀(guān)察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的大幅減少。

• 敲除BCAT1可增加miR200c的表達(dá)。

• 另外兩種可以靶向SOX2 mRNA的microRNA：miR429和miR21-5p，在BCAT1敲除后也表現(xiàn)出類(lèi)似的效果，盡管它們?cè)谵D(zhuǎn)移細(xì)胞中表達(dá)水平不同。

• 添加DM-α-KG(一種能夠穿透細(xì)胞膜的α-KG類(lèi)似物)，可以在L2和L6細(xì)胞中以劑量依賴(lài)性的方式降低SOX2的表達(dá)。

• DM-α-KG治療也增加了轉(zhuǎn)移細(xì)胞中的miR200c。

因此，研究人員認(rèn)為：

BCAT1-α-KG-miR200c-SOX2

調(diào)控途徑成立！

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)BCAT1在轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，調(diào)控其遷移轉(zhuǎn)移，并與不良預(yù)后相關(guān)。該研究確定了一條新的通路，其中α-KG是轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞中BCAT1和SOX2表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控之間的關(guān)鍵代謝信號(hào)傳導(dǎo)中間體。

這些發(fā)現(xiàn)可能為靶向肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的治療開(kāi)辟新的策略。