養(yǎng)細(xì)胞的小伙伴,最怕遇到的,大概就是細(xì)胞污染了。
這細(xì)菌和真菌污染好辨別,處理起來雖然麻煩,但也不是毫無辦法。相比起來,支原體污染才是防不勝防。
顯微鏡很難捕捉到它們的身影,與細(xì)胞共存在同一培養(yǎng)體系下,還跟細(xì)胞搶吃搶喝??蓱z弱小又無助的細(xì)胞根本不是支原體的對(duì)手,只能茍延殘喘,狀態(tài)一代不如一代,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。
多數(shù)情況下,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞疑似支原體污染,直接丟掉然后清理環(huán)境即可。但在一些特殊實(shí)驗(yàn),比如:細(xì)胞保種、抗體藥生產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)或是細(xì)胞治療過程中,則需要對(duì)細(xì)胞例行支原體檢測(cè),以確保細(xì)胞的純凈。
支原體常規(guī)檢測(cè)法之經(jīng)典法
這里指的是基于經(jīng)典法試劑盒:Venor®Gem qEP的檢測(cè)方法。
關(guān)于qPCR大家應(yīng)該都不陌生:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)
是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。
在支原體經(jīng)典法檢測(cè)試劑盒中,無需RNA提取和反轉(zhuǎn)錄步驟,樣品僅需待檢測(cè)的細(xì)胞上清或是從上清中提取的DNA。
經(jīng)典法試劑盒:Venor®Gem qEP使用方法
一、樣品制備:
①濃縮:當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí),即可收集上清開始檢測(cè),可對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)濃縮。
注:濃縮僅適用于支原體的完整性,避免濃縮前支原體被破壞(如熱滅活)。
②穩(wěn)定:細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩(wěn)定化處理。如果立即進(jìn)行DNA抽提,則忽略這一步。
③DNA 抽提:大量證據(jù)表明,DNA抽提可實(shí)現(xiàn)最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法,但應(yīng)適合支原體基因組。我們推薦:
Venor®GeM Sample Preparation kits (貨號(hào)56-1010/-1050/-1200) 適合手動(dòng)DNA抽提
這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過大量驗(yàn)證,具體流程參見試劑盒說明書。另外Venor®GeM qEP kit包含的內(nèi)控DNA對(duì)照,也用于驗(yàn)證DNA抽提步驟(內(nèi)控原理:已知濃度的細(xì)胞,包含內(nèi)部控制DNA序列,該序列不和現(xiàn)有的任何有機(jī)體序列同源,對(duì)檢測(cè)的DNA樣品干擾極小。在DNA提取前,將該內(nèi)控細(xì)胞和樣品一起加入細(xì)胞裂解液中,被一起提取出來。和靶點(diǎn)樣品一起進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),內(nèi)控DNA序列的成功擴(kuò)增提示靶點(diǎn)DNA的提取成功)。
二、試劑制備與PCR
另外,下列儀器已經(jīng)通過PCR反應(yīng)驗(yàn)證:
三、試劑制備與PCR
FAM通道檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。依據(jù)DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值定量。具體步驟需參考具體qPCR 儀及軟件的功能。我們推薦對(duì)包括對(duì)照在內(nèi)的每個(gè)樣品的擴(kuò)增曲線進(jìn)行評(píng)估。
Ct<40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。支原體DNA越多,F(xiàn)AM通道信號(hào)越高,檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的HEX通道信號(hào)越低。
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