支原體是真正的細菌,但它們沒有細胞壁,因此與“經典”細菌相比,它們的多形性更高。 由于支原體在細胞形態(tài)上具有可塑性,并且細胞尺寸較小,因此甚至可通過0.1μm的濾器。 這也是為什么它們作為細胞培養(yǎng)衍生的生物制劑的潛在污染物而受到關注的原因之一,尤其是當生物反應器為支原體生長提供有利條件時。支原體在人、動物、植物和昆蟲中普遍存在,因此,在生物制藥過程中使用的任何動植物來源原料都可能含有支原體。 另一方面,某些支原體通過生物膜可以在環(huán)境中長期生存。
支原體檢查是生物制藥生產過程中質量控制(QC)的重要組成部分。但是,通過藥典規(guī)定的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢查支原體有時會帶來重大挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括:
1. 支原體很小,顯微鏡下不可見。
2. 支原體物種很多,有一百多種。
3. 支原體有特殊的營養(yǎng)需求,有些不可培養(yǎng)。
4. 有些支原體只產生輕度的濁度變化,肉眼不易辨別。
因此,少量的支原體污染可能在很長一段時間內都不會被發(fā)現(xiàn),而災難性的后果則是生產時間的浪費和相當大部分的收入損失。
在細胞研究領域,支原體也是臭名昭著的污染源,許多實驗室都深受其害。早在1993年的研究顯示,美國FDA實驗室的兩萬個Hela細胞培養(yǎng)物中有15%受到了支原體的污染?,F(xiàn)在,供應細胞和試劑的公司都會進行非常嚴格的支原體篩查。
又有人曾獲得了九千多份樣本的RNA測序數(shù)據(jù),這些樣本來自于2012年-2013年間哺乳動物細胞的基因表達研究。他們在測序數(shù)據(jù)中尋找支原體DNA,結果發(fā)現(xiàn)11%的樣本都受到了支原體的污染。支原體DNA水平gao的一些研究,曾發(fā)表在一些頂jian期刊上。雖然支原體污染并不一定意味著這些研究結果無效,但這種微生物會影響數(shù)百個基因的表達,并與細胞競爭營養(yǎng)阻礙細胞的生長。在其中一組受污染的數(shù)據(jù)中(淋巴瘤細胞),也有人鑒定出61個被支原體改變的基因。據(jù)估計,在上世紀九十年代,支原體污染率是四分之一。
近一直在開發(fā)和實施的用于快速支原體檢測的核酸擴增技術(NAT) 已越來越受到重視。驗證后的方法可成為用于過程控制和批次放行檢測的預警系統(tǒng)。由于它們的巨大優(yōu)勢,預計它們將在將來越來越多地用于代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)方法進行支原體檢測。這可能會*改變生物技術和生物制藥行業(yè)的質量控制和批次放行方案。
目前,市面上已有多個品牌的支原體PCR和qPCR檢測試劑盒,有用于細胞支原體篩查的,也有可用于制藥企業(yè)放行檢測的。需要指出的是,用于制藥企業(yè)的PCR或qPCR方法需要進行方法驗證,可使用一些國外提供的標定好的支原體菌株(10CFUTM支原體標準品)和支原體基因組DNA(拷貝數(shù)已經標定)。它大大方便了NAT方法的驗證過程,為NAT替代傳統(tǒng)藥典方法提供了依據(jù)。
另需注意:按照國外藥典,支原體菌株和樣品需經支原體DNA抽提后,才能進行PCR檢測。因此,選擇合適的支原體DNA提取試劑盒也是需要考慮的因素。
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