要選一款合適的支原體檢測(cè)試劑盒,有如下幾個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo):
1. 靈敏度。
靈敏度常用支原體基因組的拷貝數(shù)或支原體菌株的CFU表示。
2. 特異性和廣譜性。
質(zhì)量好的試劑盒應(yīng)檢測(cè)的支原體物種越多越多,并且特異性強(qiáng),即只針對(duì)支原體,不針對(duì)其他細(xì)菌等微生物,沒(méi)有交叉反應(yīng)。
3. 穩(wěn)定性。
凍干粉比液體試劑的穩(wěn)定性高。
4. 樣本類型及樣本處理。
一款好的試劑盒,會(huì)標(biāo)出它適合的樣本類型,也會(huì)說(shuō)明如何處理樣本。要注意有的樣本含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì),因此需要處理。
5. 對(duì)照品。
一個(gè)好的試劑盒,會(huì)帶有陽(yáng)性對(duì)照和內(nèi)控對(duì)照。內(nèi)控對(duì)照是用于監(jiān)測(cè)PCR是否正常。如果樣本含有抑制PCR的物質(zhì),則內(nèi)控對(duì)照的條帶會(huì)發(fā)生缺失。有嚴(yán)重支原體污染的樣本由于樣本中的支原體對(duì)內(nèi)控對(duì)照產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)性抑制,因此支原體條帶越強(qiáng),內(nèi)控條帶越弱(下圖)。
圖. 1. 100 bp DNA Ladder;2. 陰性對(duì)照,有內(nèi)控條帶;3. 陽(yáng)性對(duì)照,有支原體陽(yáng)性條帶;4. 樣本有PCR抑制劑;5.陰性樣本;6.陽(yáng)性樣本,支原體污染較輕;7.陽(yáng)性樣本,支原體污染較重。圖片來(lái)自Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的Venor®GeM Advance支原體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
但支原體核酸檢測(cè)法(NAT)并沒(méi)有載入我國(guó)藥典。我們藥典的是支原體培養(yǎng)法和DNA染色法。但2018年《中國(guó)藥事》第8期上,中國(guó)食品藥品檢定研究院刊發(fā)了一篇文章——《支原體檢查的核酸檢測(cè)方法及方法學(xué)驗(yàn)證的思考》,提出提出要與接軌,逐漸推進(jìn)NAT的開(kāi)展,因其“具有快速、靈敏、便捷等特點(diǎn)”。
歐洲藥典規(guī)定,核酸法如替代培養(yǎng)基,核酸法的靈敏度需達(dá)到10 CFU·mL-1;如替代DNA染色法,核酸法的靈敏度需達(dá)到100 CFU·mL-1。該文也提出,需對(duì)NAT進(jìn)行特異性、低檢出限和耐用性的驗(yàn)證。
因此,對(duì)于需要NAT法檢查支原體的生物制品和細(xì)胞治療產(chǎn)品企業(yè),可選擇試劑盒已經(jīng)驗(yàn)證并提供有參比物質(zhì)的廠家,盡管后續(xù)仍需按照待測(cè)樣本類型進(jìn)行方法的適用性驗(yàn)證,并同步開(kāi)展藥典方法的平行檢測(cè)研究,但已為NAT法檢查支原體帶來(lái)極大的方便。
Minerva Biolabs公司是著名的微生物污染控制公司,創(chuàng)始人來(lái)自于德國(guó)的羅伯特·科赫微生物研究所。其支原體檢測(cè)和祛除產(chǎn)品,在世界上居于較高位置。其中提供的用于藥品或生物制品企業(yè)過(guò)程控制的試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)品如下:
(qPCR法)支原體檢測(cè)試劑盒
英文品名: Venor®GeM qEP
貨號(hào)與規(guī)格: 11-9025,25 tests/盒
11-9100,100 tests/盒
11-9250,250 tests/盒
(PCR法)支原體檢測(cè)試劑盒
注:不含聚合酶
英文: Venor® GeM Classic
貨號(hào)與規(guī)格: 11-1025,25 tests/盒
11-1050,50 tests/盒
11-1100,100 tests/盒
11-1250,250 tests/盒
10CFU支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品
品名:10CFU™ Sensitivity Standards
產(chǎn)品 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | NCTC | ATCC |
精氨酸支原體 | 102-1003 | 3管10CFU支原體標(biāo)準(zhǔn)品+2管陰性對(duì)照/盒 | 10129 | 23838 |
口腔支原體 | 102-2003 | 10112 | 23714 | |
雞敗血支原體 | 102-3003 | 10115 | 19610 | |
肺炎支原體 | 102-4003 | 10119 | 15531 | |
關(guān)節(jié)液支原體 | 102-5003 | 10124 | 25204 | |
發(fā)酵支原體 | 102-6003 | 10117 | 19989 | |
豬鼻支原體 | 102-7003 | 10130 | 17981 | |
萊氏無(wú)膽甾原體 | 102-8003 | 10116 | 23206 | |
螺原體 | 102-9003 | 10164 | 27556 | |
支原體套裝 (包含EP 2.6.7/ JP17版G3章列舉的所有支原體物種) | 102-0002 | 2管10CFU支原體標(biāo)準(zhǔn)品+2管陰性對(duì)照/盒 | -- | -- |
100CFU支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品
品名:100CFU™ Sensitivity Standards
產(chǎn)品 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | NCTC | ATCC |
精氨酸支原體 | 103-1003 | 3管10CFU支原體標(biāo)準(zhǔn)品+2管陰性對(duì)照/盒 | 10129 | 23838 |
口腔支原體 | 103-2003 | 10112 | 23714 | |
雞敗血支原體 | 103-3003 | 10115 | 19610 | |
肺炎支原體 | 103-4003 | 10119 | 15531 | |
關(guān)節(jié)液支原體 | 103-5003 | 10124 | 25204 | |
發(fā)酵支原體 | 103-6003 | 10117 | 19989 | |
豬鼻支原體 | 103-7003 | 10130 | 17981 | |
萊氏無(wú)膽甾原體 | 103-8003 | 10116 | 23206 | |
唾液支原體 | 103-1103 | 10113 | 23064 |
注意:
使用時(shí),應(yīng)嚴(yán)格遵循說(shuō)明書(shū)操作流程。任何偏離可能會(huì)造成結(jié)果誤差。
加入100CFU標(biāo)準(zhǔn)品的樣品不能超濾濃縮,否則會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不可靠。
100CFU/ml不能稀釋為10CFU/ml,因支原體存在集聚現(xiàn)象,在溶液中非均一狀態(tài)。
上海締一生物生物科技有限公司作為Minerva公司中國(guó)區(qū)總代理,十幾年來(lái),不斷為中國(guó)生物研究實(shí)驗(yàn)室,以及眾多生物制品企業(yè),提供了完整高效的支原體等微生物檢測(cè)及祛除解決方案。如有任何需求,可與我們聯(lián)系。