如果實驗短期內(nèi)用不完的血清反復(fù)凍融在一定程度上對血清內(nèi)的蛋白活性存在影響,從而影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成功率,我們來看看反復(fù)凍融都有哪些影響。
曾有研究發(fā)現(xiàn),血清凍融三次,對腫瘤標(biāo)志物的濃度影響不大1,對于血漿,有報道在短時間內(nèi)反復(fù)凍融三次,對總蛋白、白蛋白和免疫球蛋白含量影響不大,但作者推測對免疫球蛋白的活性有影響2。重要的是一篇西北民族學(xué)院的文章,《反復(fù)凍融新生牛血清對促細(xì)胞生長效應(yīng)的影響》,作者針對SP2/0細(xì)胞,用MEM培養(yǎng)基和三批新生牛血清進行培養(yǎng)。血清分別凍融4次至28次不等。然后繪制細(xì)胞生長曲線,根據(jù)公式t =T/A , A=log2
Y/X計算細(xì)胞倍增時間(t 為細(xì)胞倍增時間, Y 為細(xì)胞峰值前1 d 的細(xì)胞數(shù), X 為接種細(xì)胞數(shù), T 為細(xì)胞生長時間)。結(jié)果顯示:選用的三批新生牛血清在反復(fù)凍融 28 次時, 血清促細(xì)胞生長的大增殖量變化不大,均高于1×106/mL, 但是血清促細(xì)胞生長的倍增時間在反復(fù)凍融 20次時延長, 即血清促細(xì)胞繁殖一代所需的時間在凍融次數(shù)達到 20 次時顯著增加。筆者觀察了一下該文章的結(jié)果列表,發(fā)現(xiàn)在凍融20次之前,細(xì)胞倍增時間延長2-3小時不等,20次時,則延長3-4小時??梢?,影響還是比較顯著的。該文章的局限是針對新生牛血清,而沒有對胎牛血清進行測試。
國外有人對大鼠血清中的18種化學(xué)成分進行了檢測,發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融3次對其中的14種成分沒有顯著影響,其他肌酸激酶,甘油三酯,葡萄糖,膽紅素,甚至包括氯離子有一些明顯變化,但其濃度變化控制在10%以內(nèi)。3
總而言之,如果能避免牛血清的反復(fù)凍融,及時分裝,那是好的。如果在短時間內(nèi)有幾次反復(fù)凍融,也不用過于擔(dān)心。但是,對于胎牛血清,還有一個問題,是反復(fù)凍融增高了血清產(chǎn)生沉淀或渾濁的風(fēng)險。因為血清在融化時,冰塊和蛋白融化的速度是不一樣的,局部可能因蛋白濃度過高而產(chǎn)生沉淀。同時,如果血清內(nèi)含有少量纖維蛋白原,那么在低溫下也可以形成絮狀沉淀4,等到血清再融化時,沉淀就顯現(xiàn)出來了。所以,血清的質(zhì)量也非常重要。