1. 如果收到一管凍存的細胞,能直接把它放到液氮中保存嗎?
在很多情況下,干冰(-80°C)運輸?shù)募毎梢苑呕匾旱?,之后再進行快速解凍。然而,這樣處理后可能降低細胞活力。對于一些敏感的細胞系,這可能使細胞復蘇更加困難。這種現(xiàn)象被認為是由于溫度變化導致的細胞內冰晶結構的改變。因此,建議細胞在收到后應盡快解凍和培養(yǎng)。減少在-80°C的儲存時間,這種溫度只用于運輸。
2. 從液氮中取出細胞復蘇時,應采取哪些安全措施?
在液氮中的細胞凍存管如果沒有*密封,有液氮漏入,解凍時凍存管的氣溫急劇上升,可能會導致爆炸。因此,當從液氮中取出細胞時,建議佩戴護目鏡和防護手套。復蘇時,應將凍存管在37°C水浴中不斷搖動,在1-2分鐘內使凍存液*融化。之后用酒精棉球擦拭凍存管外壁,再拿入超凈臺內,將細胞轉移到已加入10ml培養(yǎng)液的離心管內,1000 rpm下離心5~10分鐘,棄去上清液,加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中,置 5% CO2孵箱靜置培養(yǎng)。
3、為什么應將細胞儲存在液氮罐中的氣相而非液相?
細胞儲存在液氮氣相中更容易復蘇。而在液氮的液相中,如果凍存管沒有正確密封或有泄漏,細胞與液氮直接接觸,會使細胞解凍后活力受到影響。
4、對于懸浮細胞,如何更換培養(yǎng)基?
培養(yǎng)懸浮細胞可以只是簡單地添加新鮮培養(yǎng)基(如果空間允許)或者通過離心(100×g 5分鐘)從舊培養(yǎng)基中分離細胞,隨后將沉淀的細胞再懸浮于新鮮培養(yǎng)基中。然而,對于大多數(shù)懸浮細胞系,簡單添加培養(yǎng)基是更好的方法。無論哪種方法,都需要細胞達到其zui大飽和密度之前更新培養(yǎng)基。細胞的飽和密度在3×10 5至2×10 6之間,具體依賴于細胞系和培養(yǎng)條件(靜置或攪動、氧合水平等)。細胞必須稀釋至較低的細胞濃度以允許足夠的營養(yǎng)物質恢復,使細胞保持對數(shù)生長。假如只是簡單地更換培養(yǎng)基而不降低細胞密度,細胞就會迅速耗竭培養(yǎng)基并死亡。如果細胞被稀釋到其zui小密度之下,則會進入滯后期,生長非常緩慢,或者會死亡。每種懸浮細胞系的飽和密度和傳代間隔都不一樣,因此,每日細胞計數(shù)是監(jiān)測懸浮細胞系的*方式。
5. 細胞培養(yǎng)推薦的CO2水平是多少?
盡管細胞培養(yǎng)體系中的CO2水平范圍為0.03%~40%(通常大氣中的CO2約0.03%),但zui常見的在空氣中不添加CO2或者CO2濃度為5%~10%。調節(jié)培養(yǎng)基中碳酸氫鈉的濃度以與氣相中CO2水平達到平衡非常重要。細胞會產生CO2,需要少量的碳酸用于生長和存活。如果不添加CO2并且細胞大量繁殖,則可以使用4mM(0.34g / L)的無水碳酸氫鈉。然而,這時培養(yǎng)瓶蓋子應擰緊。如果培養(yǎng)體系需要5%或10%的CO2,則在37℃下分別使用23.5mM(1.97g / L)或47mM(3.95g / L)碳酸氫鈉,初始pH為約7.6。在這些條件下,應使培養(yǎng)瓶松蓋或使用培養(yǎng)皿來保持氣體平衡。
6. 為什么一些細胞需要丙酮酸鈉?我應加多少丙酮酸鈉到培養(yǎng)基中?
丙酮酸鹽是糖酵解途徑中的*個容易進出細胞的有機酸代謝物。 因此,培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉能同時為合成代謝提供能量源和碳源,有助于維持某些特定的細胞,有助于細胞克隆或者在培養(yǎng)基中血清濃度降低時需要。丙酮酸鈉還有助于降低熒光引發(fā)的細胞毒性。通常加入的丙酮酸鈉終濃度為1mM。商品化的丙酮酸鈉溶液通常為100mM儲存液(100X)。
7. 培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿中的細胞密度是多少?
請參考如下數(shù)據(jù):
培養(yǎng)瓶 | 培養(yǎng)面積 | 培養(yǎng)液體積 | 細胞產量 |
T25 | 25cm2 | 5-10 ml | 2.5 x 106 |
T75 | 75cm2 | 15-20 ml | 7.5 x 106 |
T150 | 150cm2 | 30-50 ml | 15.0 x 106 |
T175 | 175cm2 | 35-60 ml | 17.5 x 106 |
T225 | 225cm2 | 45-75 ml | 22.5 x 106 |
細胞產量根據(jù)細胞密度1 x 106 cells/ cm2進行的估算。
細胞培養(yǎng)皿/板 | 培養(yǎng)面積 | 培養(yǎng)液體積 | 細胞產量 |
100 mm平皿 | 44 cm2 | 9 ml | 44 x 105 |
6孔培養(yǎng)板 | 9.40 cm2 | 2.0 – 3 ml | 9.4 x 105 |
12孔培養(yǎng)板 | 3.83 cm2 | 1.0 – 2.4 ml | 3.83 x 105 |
24孔培養(yǎng)板 | 1.88 cm2 | 0.5 – 1.2 ml | 1.88 x 105 |
48 孔培養(yǎng)板 | 1 cm2 /孔 | 0.3 – 0.6 ml | 1.0 x 105 |
96孔培養(yǎng)板 | 0.32 cm2 | 0.1 – 0.2 ml | 0.32 x 105 |
384孔培養(yǎng)板 | 0.06 cm2 | 25 – 50 ml | 0.06 x 105 |
細胞產量根據(jù)細胞密度1 x 105 cells/ cm2進行的估算。
多孔板中細胞的接種密度:
成像時*密度通常為7500-20000個細胞/孔(96孔板)和1000-4000個細胞/孔(384孔板)。 細胞密度過高會導致自動對焦困難,特別是如果細胞長滿,并且擠在一起,通常會導致一些細胞位于焦點之外。細胞密度過低,導致許多空白區(qū)域和焦點損失,特別是在使用較高放大倍數(shù)時。接種密度可以通過在培養(yǎng)板上接種不同稀釋濃度的細胞,并使其在實驗條件下生長(可以促進或阻止生長)來評估。